Perfuzní komůrkový systém pro monitorování aktivity buněk při aplikaci aditiv

Perfusion chamber system for monitoring of cell activity influenced by aditives

funkční vzorek

Stacionární komůrky používané v digitálním holografickém mikroskopu pro výzkum živých buněk neumožňují plně využít jeho hlavní přínos, což je kvantitativní monitorování dynamických dějů v buňce v reálném čase. Byl navržen perfuzní komůrkový systém, který splňuje přísné podmínky netoxičnosti a umožňuje pozorování vybrané části preparátu před a po aplikaci externího vlivu v podobě aditiv přidávaných do média. Výměna tekutiny může probíhat buď gravitačním spádem nebo rychlým nasátím tekutiny z odpadní hadičky v závislosti na typu a rychlosti reakce. Hlavní částí systému je uzavřená komůrka, která jednak zabraňuje vysychání kultivačního media během několikahodinových expozic při reakci buněk na aplikované aditivní látky a jednak umožňuje řízený proplach. Komůrka je tvořena separační podložkou na jejíž čelní plochy jsou vzduchotěsně uzavřeny krycími průhledy. Vnější tvar komůrky je 24x50x4,6 mm a byl odvozen od manipulačního prostoru v daném mikroskopu a to především s ohledem na pracovní vzdálenosti kondenzorů a objektivů. Tvar pracovního kultivačního prostoru včetně vtoku a výtoku byl optimalizován pro minimalizaci turbulentního proudění s důrazem na rychlou výměnu kapaliny. Optimalizace byla provedena experimentálně i simulacemi v CFD (Computational fluid dynamics) programu FLUENT. Separační podložka je odlita ze silikonového eleastomeru jejíž čelní plochy pro nasátí mají po odlití rovinnost, která je blízká rovinnosti hladiny roztaveného olova. Jako krycí průhledy byly adhezně nasáty mikroskopová krycí sklíčka o tloušťce 0,17 mm, které spolehlivě vykazují těsnost systému jak při gravitačním zaplavování pracovního prostoru při atmosférickém tlaku tak i při jeho podtlakovém vyprazdňování. Vytváří dostatečně pevný spoj pro dané rychlosti proudění kapaliny. Vtok a výtok jsou realizovány nálevkovitým tvarem s rozšiřujícím se průměrem směrem dovnitř pracovního prostoru komůrky. Perfuzní systém je tvořen teflonovými hadičkami s vnitřním průměrem 0,8 mm, které jsou vzduchotěsně spojeny s elastomerovou separační podložkou. Na teflonové hadičky jsou napojeny pružné silikonové hadičky, které propojují na jedné straně zásobník s tekutinou v podobě válcové části injekční stříkačky a na druhé straně odtok z komůrky s odpadní nádobkou. Distribuční systém umožňuje postupně připojovat až čtyři zásobníky s odlišnými koncentracemi roztoku či chemickým složením. Zásobníky kapaliny jsou uchyceny v držáku připevněném přímo k mikroskopu. Celý systém je ve vyhřívané komoře mikroskopu pro zajištění temperance tekutiny a všech komponent systému. K ovládání výměny tekutiny slouží uzávěry hadiček před vtokem do pracovního prostoru a za jeho výtokem. Všechny části perfuzního systému jsou rozebíratelné, sterilizovatelné v koncentrovaném alkoholu a znovu použitelné. Systém je přednostně vyvinut pro transmisní holografický mikroskop s řízenou koherencí, ale lze ho použít i pro jiné typy optické mikroskopie. Experimentálně byla prokázána neměnnost komplexní amplitudy obrazu po proplachu pracovního kultivačního prostoru a odolnost vůči vysychání media během 24 hodinového pozorování buněk.

Stationary observation chambers have been used in the digital holographic microscope for the research of living cells. However they don't enable to exploit fully the potential of the microscope which lies in real-time monitoring of live cell dynamics. A perfusion chamber system was designed to meet the strict nontoxicity conditions. It allows for monitoring of the chosen part of the sample before and after the application of the external stimuli (additives in medium). The liquid exchange is arranged either by the gravitational gradient or by a quick suck of the liquid from the waste drain tube according to the type of the reaction. The main part of the system is a closed chamber to avoid the exsiccation of the medium during long-hours expositions. Simultaneously it allows for controlled perfusion. The chamber consists of a spacer with frontal sides hermetically closed by cover slips. The outer dimensions of the chamber (24x50x4.6) were derived from the available space considering the working distance of condensers and objectives. The cultivation working space including the intake and outlet were optimized for the minimization of turbulent flow and quick liquid exchange. The optimization was performed both experimentally and theoretically by simulations in CFD (Computational fluid dynamics) in the program FLUENT. The frontal parts of the silicon elastomer casted spacer for the hermetic joints have a planarity similar to the surface of molten lead. Microscope cover slips of the thickness of 0,17 mm sucked to the spacer frontal sides prove the tightness of the system in the case of both the gravitational perfusion by the atmospheric pressure and the suction. It forms an adequately strong joint for required speeds of liquid flow. The intake and outlet are realized by the funnel shape with an increasing diameter to the inside of the chamber. The perfusion system is formed by the teflon tubes (inner diameter of 0,8 mm) hermetically joined to the elastomer spacer. The silicon tubes are extended by the flexible silicon tubes which provide connections with the liquid reservoir on one side and the waste container on the other side. The liquid reservoir is formed by the cylindrical part of the injection syringe. The distribution system enables to connect stepwise to four containers with different concentrations or chemical structure of liquids. These containers are placed in a holder which is attached directly to the microscope. The whole system is in the heating chamber of the microscope to guarantee the liquid and all components temperation. To control the flow the stoppers on both sides of the chamber are placed. All parts of the system are collapsible and enable for concentrated-alcohol sterilization and therefore reusable. The system is preferentially designed for the transmitted-light coherence-controlled holographic microscope but it is well utilizable for other microscope types. The stability of the image complex amplitude after the perfusion was experimentally demonstrated, so was the drying up resistance in a time period of 24 hours of live cells observation.

19.11.2010

ÚFI FSI VUT v Brně

http://holomek.fme.vutbr.cz/